Приложение ? :
Описание некоторых лабораторно-практических работ, используемых
при апробации спецкурса 'Белок - основа жизни'.
I. Выделение белков из тканей и биологических жидкостей.
Цель: выявить содержание белков в тканях и биологических
жидкостях.
1.1. Выделение казеина из молока.
Вариант I.
В химический стакан вместимостью 50 мл отмеривают цилиндром 3
мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают
и добавляют 10-15 капель 1%-ного раствора соляной кислоты. Кислоту
приливают аккуратно, по каплям, так как в избытке кислоты осадок
растворяется. Суспензию перемешивают, через 3-5 минут образуется
рыхлый осадок.
Для удаления соляной кислоты в стакан добавляют 10 мл
дистиллированной воды, перемешивают и оставляют ещё на 5 минут.
Жидкость осторожно сливают с осадка. К осадку ещё раз добавляют 10
мл дистиллированной воды, осторожно перемешивают содержимое стакана
и через 5 минут фильтруют смесь через бумажный фильтр.
Доказательством того, что в состав казеина входит фосфор:
осадок с фильтром переносят в широкую пробирку с обратным
холодильником и добавляют 6 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия.
Пробирку нагревают на песчаной бане в течение 1 часа. Жидкости дают
остыть и нейтрализуют её концентрированной азотной кислотой до
слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок
высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белка.
После отстаивания жидкость фильтруют и с фильтратом проделывают
биуретовую реакцию и молибденовую пробу на фосфорную кислоту. К 5
каплям гидролизата добавляют 10%-ый раствор NaOH и 2 капли 1%-ого
раствора CuSO4. Наблюдается фиолетовое окрашивание. К 10 каплям
молибденового реактива добавляют 5 капель гидролизата и кипятят
несколько минут. В присутствии H3PO4 жидкость окрашивается в лимонно-
жёлтый цвет. При охлаждении выпадает жёлтый кристаллический осадок
комплексного соединения (NH4)3PO412MoO3.
Вариант II.
К 50-ти мл свежего молока добавляют равный объём насыщенного
раствора сульфата аммония. При этом выпадают в осадок альбумины и
казеин. Отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр раствор
альбуминов.
1.2. Получение раствора яичного альбумина.
Осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и
выливают белок в стакан вместимостью 500 мл. В тот же стакан
добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое стакана
тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.
Затем раствор переносят в мерный цилиндр, и объём раствора
доводят до 300 мл добавлением дистиллированной воды. Раствор
оставляют на 30 минут при комнатной температуре для образования
хлопьевидного осадка глобулинов, затем разливают в пробирки по 20
мл.
20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый
фильтр. Фильтрат, содержащий яичный альбумин, используют для
дальнейшей работы.
1.3. Выделение белков мяса.
Помещают в стакан 40-50 г пропущенного через мясорубку
обезжиренного мяса, добавляют 80-100 мл 10%-го раствора NaCl и
оставляют смесь стоять 15-20 минут при частом помешивании.
Отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр или через двойной
слой марли окрашенную в красный цвет жидкость. В растворе содержатся
главным образом, мышечный альбумин и глобулин.
1.4. Выделение растительных альбуминов.
25 грамм пшеничной муки смешивают со 100 мл дистиллированной
воды, и смесь стряхивают в течение одного часа с помощью
встряхивателя. Взвесь муки центрифугируют и надосадочную жидкость
фильтруют через складчатый фильтр. Отфильтрованный прозрачный
раствор содержит преимущественно альбумин пшеничных зёрен.
II. Реакции осаждения белков.
Цель: выявить влияние различных органических и неорганических
веществ на осаждение белков. Изучить физические свойства белков.
2.1. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.
В три сухие пробирки наливают по 1-2 мл концентрированной HNO3,
H2SO4, HCl. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке
добавляют из пипетки по 0,5 мл исследуемого раствора белка, так
чтобы он не смешивался с кислотой. Вместе соприкосновения двух
жидкостей появляется белый аморфный осадок белка. При встряхивании
nq`dnj, выпавший при действии HNO3, увеличивается, а осадки выпавшие
при действии HCl и H2SO4, растворяются в их избытке.
Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимые
осаждения белков. Это связано как с дегидратацией белковых молекул,
так и с денатурацией белка.
2.2. Осаждение белков органическими кислотами.
В две пробирки добавляют по 2-3 мл раствора белка и добавляют в
одну из них несколько капель 5%-го раствора трихлоруксусной кислоты
(ТХУ), а в другую - несколько капель 20%-го раствора
сульфосалициловой кислоты. В обоих случаях наблюдается выпадение
осадка белка. Сульфосалициловая и ТХУ кислоты являются
чувствительными и специфическими реактивами на белок.
ТХУ кислота осаждает только белки и не осаждает продукты
распада белка и аминокислоты, поэтому ею пользуются часто для
полного удаления белков из биологических жидкостей (например,
сыворотки крови).
2.3. Осаждение белков солями тяжелых металлов.
В две пробирки добавляют по 1-1,5 мл исследуемого пастора
белка, по каплям при встряхивании, добавляют в одну из них раствор
CuSO4, а другую -
Pb(CH3COO)2. Выпадает хлопьевидный осадок вследствие образования
малорастворимого солеобразного соединения (с солью меди - голубого
цвета). При избытке реактива осадок снова растворяется.
Соли тяжелых металлов (Hg, Ag, Cu, Pb и др.) вызывают
необратимое осаждение белков, образуя с ними нерастворимые в воде
соединения. Потому что белки применяют в качестве противоядия при
отравлении, например, ртутными солями (сулема).
III. Гидролиз белка.
Цель: дать учащимся представление о кислотном, щелочном и
ферментативном гидролизе белка. Опытным путём установить продукты
распада белковой молекулы.
3.1. Кислотный гидролиз простого белка.
При гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные
продукты - пептоны, затем на полипептиды и, наконец, на
`lhmnjhqknr{.
Для гидролиза отмеривают в круглодонную колбу 20 мл раствора
яичного белка и 5 мл концентрированной HCl. Колбу закрывают пробкой
с длинной стеклянной трубкой. Кипятят содержимое колбы под тягой в
течение 45 или 90 минут.
Открытие промежуточных продуктов распада белка в гидролизате
при помощи биуретовой реакции. Промежуточные продукты распада белка
- пептоны - при проведении биуретовой реакции дают розовое или
красное окрашивание, а белки - сине-фиолетовое.
3.2. Ферментативный гидролиз белка.
Подготовительный